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Home > 국가방사선비상진료센터 > 방사선 비상진료개론 > 피폭방사선량 평가
  • 물리적 선량평가
  • 생물학적 선량평가

서론

이온화방사선(ionizing radiation)이 발견된 이래 농업, 산업, 의학 및 각종 연구 분야에서 그 이용도는 점차 확대되고 있다. 이와 더불어 방사선의 피해에 관한 대중의 관심 또한 커지고 있으며, 방사선 피해로 부터 인간(방사선 작업 종사자 혹은 일반 대중)을 보호하려는 노력이 계속되고 있다. 방사선 방호는 생명체와 이온화방사선의 상호작용 및 이에 따른 생물 반응을 연구하는 학문을 기초로 하며, 기본적으로 방사선량에 대한 이해를 요구한다.

흡수선량(absorbed dose)과 유효선량(effective or equivalent dose)을 나타내는 기본 단위는 그레이(gray, Gy)인데, 이것은 단위 질량당 해당 물질이 방사선을 통해 흡수한 에너지를 표시하며, 이 단위는 모든 물질과 방사선에 적용할 수 있다. 1 Gy는 1 kg의 물질이 1 J의 에너지를 흡수한 것을 표현한다. 예전에는 이러한 단위로 주로 래드(rad)가 사용되었으며 약 100 rad가 1 Gy에 해당한다.

한편 방사선 방호 분야에서는 시버트(sievert, Sv) 단위를 흔히 사용한다. 시버트는 인체가 흡수한 방사선의 양을 방사선의 종류와 조직 내 가중치를 고려하여 계산한 유효선량이다. 인체가 흡수한 방사선의 양을 방사선 종류마다 정해진 계수를 이용해 산출한다. 이 때 방사선 양은 그레이를 이용한다. 예전에는 유효 선량 단위로 주로 렘(rem)이 사용되었으며 약 100 rem이 1 Sv에 해당한다. 유효선량은 방사선의 종류 뿐 아니라, 노출된 신체부위, 노출 시간, 노출된 조직의 부피, 심지어 노출된 대상의 종류, 즉 인간인지 동물인지에 따라서도 달라지며, 법적으로 허용 범위를 정하는 기준이 된다.

일반적으로, 방사선 물질을 취급하는 작업장에서는 개인의 흡수선량을 모니터링하기 위해 물리학적 선량계측기(필름 뱃지, thermoluminescent crystals, semiconductor 등)를 사용해 왔다. 그러나, 실제 방사선 노출 사고에서는 노출된 사람들이 선량계측기를 착용하지 않은 사례가 대부분이었다. 이와 같은 경우에 물리학적 선량계측기는 대량 사고의 응급 대처에 도움이 되지 못하며, 생물학적 선량평가(biodosimetry)와 같은 생물학적 표지자를 이용한 방법이 유일한 대안이 될 수 있다.

이번 장에서는 방사선 작업자들의 노출선량 모니터링과 방사선 노출 사고의 대응이라는 측면에서, 세포유전학적 분석을 기본으로 하는 생물학적선량평가의 일반적인 원리 및 장점, 한계점 등을 논하고자 한다.

임상 소견 및 혈액학적 변화에 따른 추측선량

흡수선량과 인체의 생물학적 반응과의 관계를 규정하는 첫 번째 방법은 방사선 과노출 후에 나타나는 증상들의 강도와 빈도 및 지속기간 등을 관찰하는 것이다 (IAEA and WHO, 2000). 이런 증상들을 급성 방사선증후군(ARS)의 전구증상이라 하는데, 혈액학적 소견과 위장관계 및 신경혈관계 증상을 포함한다. 표 7-3에서 흡수선량에 따른 임상 증상을 요약하였다. 급성 방사선증후군에 의한 건강 장애 소견은 1 Gy 이상의 전신 노출량 후에 나타났으며, 2 Gy 이상의 노출량에서는 림프구와 다핵과립구 및 혈소판 수치 등 혈구수치 감소를 기준으로 스크리닝과 정확한 분류를 하였다(Waselenko et al. 2004).

표 7-3. 급성 방사선증후군의 초기 증상 (IAEA and WHO, 1998)

표 7-3. 급성 방사선증후군의 초기 증상 (IAEA and WHO, 1998)
증상 급성 방사선증후군 정도 및 급성 전신노출 선량(Gy)
Mild (1-2Gy) Moderate
(2-4Gy)
Severe (4-6Gy) Very Severe
(6-8Gy)
Lethal (>8Gy)
구토
시작
빈도
있음
~2시간
10-50%
있음
1-2시간
70-90%
있음
1시간 이내
100%
있음
30분 이내
100%
있음
10분 이내
100%
설사
시작
빈도
없음
-
-
없음
-
-
mild
3-8시간
<10%
heavy
1-3시간
>10%
heavy
1시간 이내
~100%
두통
시작
빈도
slight
-
-
mild
-
-
moderate
4-24시간
50%
severe
3-4시간
80%
severe
1-2시간
80-90%
의식
시작
빈도
정상
-
-
정상
-
-
정상
-
-
의식변성(경도)
-
-
혼수
수분
100%
체온
시작
빈도
정상
-
-
상승
1-3시간
10-80%
열감
1-2시간
80-100%
고열
1시간 이내
100%
고열
1시간 이내
100%

림프구감소증(Lymphocytopenia)은 중등도 이상 (moderate to high-dose)의 방사선 노출 시에 과립구나 혈소판의 감소 보다 조기(6-24시간 후)에 발생한다고 알려져 있다 (Dainiak 등, 2003). 표 7-4에서 보듯이 림프구 수의 감소 정도에 따라서 ARS 정도를 예측할 수 있는데, 혈구 수 측정과 같이 신속하고 일상적인 검사법을 이용하면 방사선 사고 시에 신속하게 피해자를 선별할 수 있다는 장점이 있다.

표 7-4. 최초 노출 후 6일의 림프구 절대수와 흡수선량과의 연관성 (IAEA and WHO, 1998)

표 7-4. 최초 노출 후 6일의 림프구 절대수와 흡수선량과의 연관성 (IAEA and WHO, 1998)
ARS 정도 Dose (Gy) 림프구수 (/L)
pre-clinical phase 0.1 - 1.0 1.5 - 2.5 x 109
mild 1.0 - 2.0 0.7 - 1.5 x 109
moderate 2.0 - 4.0 0.5 - 0.8 x 109
severe 4.0 - 6.0 0.3 - 0.5 x 109
very severe 6.0 - 8.0 0.1 - 0.3 x 109
lethal >8.0 0.0 - 0.05 x 109

그러나, 임상 소견 및 혈액학적 변화를 근거로 흡수선량을 산출하는 방법에는 다음과 같은 한계가 있다.

  • 1) 임상 증상과 혈구 수 감소의 정도는 흡수선량 뿐 아니라 선량률(dose rate), 노출 조직의 방사선 감수성(radiosensitivity),
    노출 면적, 노출된 기관의 손상 정도 등에 따라서도 달라진다. 또한 바이러스나 세균 등도 ARS 증상을 악화시키거나 방사
    선에 의한 손상과 유사한 증상을 일으킬 수 있다.
  • 2) 임상 증상과 혈구 수 감소를 유발시키는 최소 선량(1 Gy)은 직업 상 노출될 수 있는 선량보다 수 배 높다.실제로 방사선 작
    업 종사자들의 일반적인 허용 노출량은 상당히 낮다 (<20 mSv per year).

임상 소견과 혈구 수 감소를 근거로 흡수선량을 정확히 산출하기는 어렵지만, 다수의 희생자가 발생하는 대량 방사선 노출 사고 시에는 초기 선별과 적절한 치료방침을 신속히 결정하기 위해 사용될 수 있다. 보다 정확한 선량 평가를 위해서는 다음에서 설명할 세포유전학적 선량평가가 필요하다. 세포유전학적 선량평가는 방사선에 의한 염색질 구조 변화를 근거로 선량을 산출하는 방법이다.

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세포유전학적 선량평가

유전적 불안정성은 염색질 구조 변화와 직접 연관이 있고, 결국 염색체 변형을 일으킨다. 염색체 변형은 발생 기전에 따라 분류할 수 있는데, 염색질형(chromatid-type) 변형은 화학물질에 의해 발생하며, 염색체형(chromosome-type) 변형은 이온화방사선에 보다 특이적이다.

염색체 변형에 관한 연구에 가장 흔히 이용되는 세포는 림프구와 섬유아세포(fibroblast)이다. 휴지기에 있는 이들 세포에 이온화방사선이 조사되면 세포 주기가 계속되는 동안 DNA 손상이 지속적으로 일어난다. 즉, 방사선에 의한 염색체 변형을 관찰하기 위해서는 세포 증식을 인위적으로 유발하여 DNA가 합성되는 S phase 동안 DNA 손상이 일어나게 하고, 이후 정지하게 해야 한다. 일반적으로 세포유전학적 선량평가를 위해서 섬유아세포 보다는 림프구를 이용하는데, 림프구 배양이 섬유아세포 배양에 비해 배양 시간이 짧고 오염의 위험도가 낮을 뿐 아니라 림프구는 정맥 채혈에 의해 간단히 얻을 수 있는 반면 섬유아세포를 얻기 위해서는 생검(biopsy)이 필요하기 때문이다. 또한, 림프구는 혈액 내에서 전신을 순환하기 때문에 생물학적 선량평가의 좋은 모델이 될 수 있다 (Garcia-Sagredo, 2008).

  • ㆍ세포유전학적 분석을 통한 선량평가의 원리는 다음과 같다. :
    • In-vitro culture 시에 림프구는 mitogen에 의해 자극을 받아 분열을 시작하는데, 일반적으로 사용되는 mitogen으로 phytohemagglutinin (PHA)이 있다.
    • 응축되고 잘 구별되는 염색체는 세포분열 중기(metaphase)에 관찰되는데, 중기에서 세포주기를 멈추기 위해서는 colcemid라는 arresting agent를 첨가해 주어야 한다. colcemid는 염색체 분열의 anaphase 동안 microtubule의 polymerization을 억제함으로써 mitotic spindle 형성을 방해한다.
    • 중기 세포를 채취하여 고정하고 염색하면 염색체 변형을 관찰할 수 있는데, 변형염색체를 가진 세포의 생존력에 따라 불안정형(unstable) 혹은 안정형(stable) 염색체변형으로 구분할 수 있다. 즉, dicentric 염색체, acentric rings, acentric fragments 등은 불안정형 염색체변형에 속하고, insertion, reciprocal and non-reciprocal translocation 등은 안정형 염색체변형에 속한다.

불안정형 염색체 변형은 대개 유전물질의 소실을 동반하는데, 두 가지 기전으로 일어날 수 있다. 즉, ① acentric fragment가 anaphase 동안 mitotic spindle에 감기지 못하고 소실되거나, ② dicentric 염색체로부터 만들어진 anaphase bridge가 해당 염색체를 균열시켜 소실되는 경우이다. 이 때문에 이온화방사선에 노출되고 3개월이 지난 후에는 선량평가에서 실제보다 낮은 선량(underestimation)이 계산될 수 있다(Lloyd, 1998). 반면, 안정형 염색체변형의 경우에는 계속되는 세포분열 주기를 통해 전달될 수 있기 때문에 장기간에 걸쳐 누적된 흡수선량을 평가하는데 이용된다(Leonard 등, 2005).

1) Dicentric scoring : 흡수선량과 선량-반응 곡선

염색체 변형을 분석하여 방사선 노출을 검출하고 흡수선량을 정량하는 연구가 최초로 수행되고 발표된 것은 1962년 Bender와 Gooch 등에 의해서이다(Hoffmann and Schmitz-Feuerhake, 1999). 이 연구에서는 1961년 미국 Idaho Fall에서 핵 사고로 방사선에 노출되었던 8명으로부터 얻은 1,000개의 중기세포를 분석하여 염색체 변형 빈도를 계산하였다. 사고 후 수년이 지난 후에 분석을 하였기 때문에 정량적인 선량-반응 데이터는 얻을 수 없었지만, 염색체변형이 여전히 관찰되고 있음을 알 수 있었다(Kawata 등, 2004). 이후 1960년대에는 이온화방사선 노출 사고로부터 염색체변형 분석이 성공적으로 이루어져서, dicentric 염색체 수와 물리학적으로 계측된 흡수선량 사이에 유의한 관련이 있음이 밝혀졌다.

현재는 일반적으로 1 Gy 이하의 낮은 흡수선량이 관련된 사고의 경우 500개 세포에서 염색체변형을 계수하며, 1 Gy를 초과하는 선량의 경우에는 100개의 dicentrics를 계수하는 것을 원칙으로 한다(IAEA, 2001). 그러나, 예비 분석(preliminary estimation)을 위해서는 개인 당 50개 혹은 30개의 dicentrics를 계수할 수도 있다(Lloyd 등, 2000).

채혈된 림프구를 체외에서 조사(in-vitro irradiation)하여 얻은 선량-반응(dose-effect) 관계를 방사선 조사에 의한 체내 반응을 계측하기 위한 표준곡선(calibration curve)로 이용할 수 있다는 연구가 발표되었다(Doloy 등, 1991; IAEA, 2001). 일반적으로, dicentrics 빈도는 방사선량과 관련이 있는데, 방사선의 특성(Linear Energy Transfer, LET)과 상대적 생물학적 효율(relative biological effectiveness, RBE)에 의해 달라질 수 있다.

선량-반응 곡선(dose-effect curve)은 그림 7-14에서 설명하는 것처럼 LET와 RBE에 따라서 모양과 기울기가 달라진다.

low-LET 방사선(gamma ray와 X-ray)에 대해서는 선량-반응 곡선이 2차곡선의 형태가 되어 다음과 같은 수식이 적용된다.

계산식4 Y = A +αD + βD2

  • Y : yield of dicentrics
  • A : 선량=0 일 때의 dicentrics 빈도
  • α and β : fitted parameters
  • D : 흡수선량

반면, high-LET 방사선(중성자와 알파입자)에 대해서는 선량-반응 곡선이 직선의 형태가 되어 다음과 같은 수식이 적용된다.

계산식5 Y = A +αD

그림 7-14. 방사선의 특성에 따라 달라지는 선량-반응 곡선(IAEA, 2000)

  • ㆍ세포유전학적 선량평가를 위한 dicentrics 계수법의 장점 :
    • dicentric 염색체는 이온화방사선에 특이적인 반응이다. 소수의 유전자 독성 물질들(bleomycin, neocarcinostatin, mitomycin C)이 방사선과 유사한 반응을 유발시킬 수 있으나, 주로 항암화학요법에 사용되는 약물이므로 선량평가 대상자의 병력과 치료력에 주의를 기울이면 혼동될 가능성은 낮다.
    • 노출되지 않은 사람들에서는 background가 매우 낮다(1,000개 세포 당 1-2개 정도).
    • 불안정형 염색체변형 중 빈도가 높다.
    • 검출할 수 있는 선량 범위가 상당히 넓고, 검출한계치가 비교적 낮다(low-LET에 대해서는 0.1 Gy, high-LET에 대해서는 0.01 Gy 까지 검출 가능).
    • Giemsa 염색으로 분석 원가가 저렴하다 (그림 7-15).

그림 7-15. 림프구 조사 후 검출된 불안정형 염색체변형 Giemsa 염색으로 염색하였으며, 이중심절(dicentric) 염색체와 해당하는 acentric fragment가 각각 화살표(arrow)와 원(circle)으로 표시되어 있다.

방사선의 분획 노출(fractionated exposure) 시에는, 일차 노출에 의해 발생한 인접한 염색체의 손상이 두 번째 노출에 의한 추가적인 손상이 생기기 전에 보수 기전(repair mechanism)에 의해 교정된다. 연이은 두 번의 노출 간격이 2시간 보다 길면 손상된 염색질의 결합 오류와 dicentrics 형성 등이 최소화될 수 있다.

노출 후 시간이 경과되면 dicentrics 등과 같은 불안정 염색체변형의 경우에는 저절로 림프구 순환으로부터 소실된다. 이것은 세포사멸(apoptosis) 기전에 의한 것이며, 매 유사분열 마다 50% 정도 소실된다고 알려져 있다. 따라서 노출 후 3개월이 지난 후 선량평가가 이루어지는 경우에는 흡수선량이 실제보다 저평가 될 수 있다. 이와 같이 염색체변형이 혈액으로부터 소실되는 것은 체내 면역기전에 의한 것이며, 각종 암이나 백혈병과 같은 후기 부작용을 억제하려는 생체 기전으로 생각된다(Pala 등, 2001 : Belloni 등, 2008). dicentric 염색체를 정확히 계수하기 위해서는 방사선 조사 후 첫 번째 세포분열(M1) 중기세포를 분석해야 한다.

dicentric 염색체 분석은 시간 소모가 많고 숙련된 기술이 필요한 방법이다. 최근들어서는 이와같은 기술적 어려움을 보완하기 위해서 중심절(centromere)에 보합하는 소식자를 이용한 FISH법이나 C-banding 등의 방법이 제안되고 있다.

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2) Stable aberration : 흡수선량과의 관계

dicentric 염색체 분석이 노출 후기에 과소평가된다거나 장기간에 걸친 방사선 노출 선량 분석에 제한이 있다는 점을 보완하기 위해 안정형 염색체변형 분석이 제안되었다. 불안정형 염색체변형을 가진 세포들과는 달리, 안정형 염색체변형을 포함하는 세포들은 세포주기를 거치면서 유전물질이 소실되지 않기 때문에 유사분열을 거쳐도 사멸하지 않고 생존한다. 따라서 안정형 염색체변형 분석은 방사선 노출의 후향적 분석에 유용하게 사용되는 표지자이다(Tucker, 2001).

염색체의 상호전좌(reciprocal translocation)와 삽입(insertion)은 말초혈액 내의 림프구에서 세포가 재생되는 동안에도 다른 유형의 안정형 염색체변형에 비해 오래도록 지속된다. 안정형 염색체변형을 분석하기 위해서는 불안정형 염색체변형 분석 시와 마찬가지 방법으로 세포를 배양하지만, 세포를 염색할 때에는 Giemsa 염색이 아닌 다른 방법을 사용하여 염색체 전좌를 검출해 낸다.

염색체 전좌에 대한 선량-반응 곡선은 dicentrics에 대한 선량-반응 곡선과 유사한 방법으로 얻어진다. 즉, low-LET 방사선에 대해서는 이차곡선으로, high-LET에 대해서는 직선의 관계식으로 그려진다(Bothwell 등, 2000 : Darroudi, 2000; Rodriguez 등, 2004 : Hande 등, 2005). 전좌 생성율은 노출의 조건에 따라 분명한 선량-반응 관계를 보인다. 저선량(≤1 Gy)에서는 대부분 단순한 전좌가 관찰되고, 고선량(>2 Gy)에서는 복잡한 변형이 주로 관찰된다. 복잡한 변형은 3개 이상의 염색체가 관여되는 다 방면으로의 변화에 의해 여러 곳에서 double-strand breaks (DSBs)가 일어나기 때문에 생긴다(Anderson 등, 2003 : Camparoto 등, 2003).

현재까지 많은 연구들은 후향적 인자로서의 염색체 전좌가 얼마나 정확하게 선량을 반영하는 지에 대해 검증하려 노력하였다. 지적된 일부 문제점들은 적절하게 해결되었으나, 일부 논점들은 아직도 불분명하게 남아있다.

  • ㆍ세포유전학적 선량평가를 위한 안정형 염색체변형 분석의 제한점 :
    • 염색체 전좌의 background frequency가 높음(1,000개 세포 당 2-10개)
    • 개인 별로 유의한 차이가 있다. 특히 나이(40세 이상)의 영향을 받는다.
    • dicentrics에 비해 검출 범위가 좁다.
    • 환경과 생활 습성에 따른 교란변수의 영향을 받는다.
    • 전좌를 분석할 염색체 선택을 위한 표준화된 기준이 없으며, 염색하는 방법이나 명명에 관한 표준 지침이 없다.
  • ㆍ안정형 염색체변형 분석을 위한 염색법 :

초기에는 염색체 전좌를 관찰하기 위해서 G-banding에서와 같이 단백분해 효소(트립신)를 사용했다. 그러나 이 방법은 분석에 시간이 많이 소요되고 숙련된 사람만이 판독할 수 있다는 단점이 있었다. 또한 G-banding은 소량의 염색물질의 이상이나 다수의 염색체가 관여하는 전좌를 찾아내기에 어려움이 있다. 따라서 염색체 전좌를 찾아내기 위해 사용한 것이 분자세포유전학적 방법 즉, FISH(Fluorescence in situ hybridization)법이다. FISH방법은 염색체의 특정 DNA 부위에 상보적으로 결합하는 형광 소식자를 사용해서 염색하고 이를 형광현미경 하에서 판독하는 방법이다. 이 방법은 G-banding법 보다 판독이 비교적 쉽고 객관적이며, 분석에 소요되는 시간이 짧다.

그림 7-16. 형광 소식자로 보합된 세포분열 중기 염색체 (FISH 기법), (왼쪽) 1번, 2번, 4번 염색체가 각각 2개씩 관찰되는 정상 세포, (오른쪽) 염색체 전좌 부위가 화살표로 표시된 손상 세포

대부분의 검사실에서 사용하는 프로토콜은 크기가 큰 염색체 3개를 선택하여 painting하고 판독하는 방법이다. 대형 염색체 3개를 선택하면 지놈(genome)의 20% 정도를 대변할 수 있다고 알려져 있다. 전체 염색체 전좌 빈도는 다음과 같이 Lucas 등(2000)이 제안한 방식을 사용한다.

계산식6 Fg = Fp / 2.05fp(1-fp)

  • FG : full genome aberration frequency
  • Fp : FISH법으로 검출된 translocation yield
  • fp : 분석 대상자의 성별을 고려한 FISH 분석에 포함된 유전물질의 분획(genome fraction)

위의 계산식은 관찰된 개별 염색체의 전좌 빈도가 DNA content와 비례한다는 가정을 근거로 한다. 따라서 큰 염색체 일수록 이온화방사선에 의한 영향을 많이 받을 것이라고 가정하는 것이다. 이런 가정에 대해서는 찬반의 여지가 있다. 즉, 일부 연구에서는 크기와는 상관없이 다른 염색체 보다 방사선에 민감한 염색체가 있다고 주장하고 있다. 이런 점을 고려하면, 최근 사용되는 방법인 spectral karyotype(SKY)이 필요할 수도 있다. SKY법은 모든 염색체 쌍을 대상으로 다수의 색으로 구분된 painting probe를 사용하는 기법이다. 염색체 전장에 대한 소식자를 보합시키므로 미세한 손상도 찾아낼 수 있으며, 두 개 이상의 염색체가 관여하는 복잡한 전좌도 관찰할 수 있어 방사선 노출 관련된 초기 생물학적 반응 뿐 아니라 고도 노출에 의한 “hidden aberration"까지도 검출할 수 있다는 장점이 있다.

dicentrics 계수법과 염색체 전좌 분석이 방사선 방호를 위한 목적으로 널리 쓰이고 있지만, 염색체 손상 시에 부수적으로 생산되는 부산물을 분석하는 방법도 있는데, 미소핵 분석법이 그 중 하나이다.

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3) Cytokinesis-block micronucleus (CBMN) 분석

손상에서 회복되지 않은 DNA와 세포분열 이상으로 잘못 분열된 염색체는 전체 염색체의 소실(whole-chromosome loss)을 유발할 수도 있고 중심절이 없는 염색체 파편 (acentric fragment)을 생산할 수도 있다. 세포분열 이상은 kinetochore의 손상이나 spindle fiber의 결함이 주요 원인이다. 세포 분열의 마지막 단계에서 이와같은 염색물질의 소실이 일어나 미세한 핵 모양 파편이 만들어 지는 것을 “미소핵(micronucleus, MN)"이라 부른다. 림프구 배양에서 MN을 분석하는 방법으로는 cytochalasin B를 사용하여 세포질 분열을 억제하는 방법이 선호되고 있다. 이러한 cytokinesis-block micronucleus(CBMN) 분석에서는 한 번 혹은 두 번의 분열을 마친 세포들이 세포질 분열을 하지 못하기 때문에 그림 7-17에서 보이는 바와 같이 핵이 두 개(M1 세포) 혹은 세 개인 세포(M2 세포)들이 만들어진다(Fenech 2000).

그림 7-17. 미소핵(화살표 표시)을 가진 이핵세포

  • ㆍ핵 분열 동안 미소핵(MN)과 nucleoplasmic bridge(NPB)가 생기는 기전 : 그림 7-18.

지난 10여년 간 CBMN 분석은 염색체 절단(chromosome breakage), DNA misrepair, 염색체 소실, non-disjunction, 세포괴사(necrosis), 세포사멸(apoptosis) 및 cytostasis 등을 측정하는 수단으로 발전해 왔다. 이 방법은 현재 염색체 말단에 존재하는 telomere 끼리 결합(telomere end-fusion) 해서 생기는 이중심절 염색체(dicentrics)를 나타내는 NPB와 유전자 증폭의 표지자인 nuclear budding(NBUD) 등을 측정하기 위해 사용된다. MN은 그림에서 보듯이, 핵분열 후에 세포질 분열 단계에서 어느 한 쪽으로도 이동하지 못한 전체 염색체로부터 발생할 수도 있고, 중심절이 없는 염색체 파편으로부터 발생할 수도 있다.

그림 7-18. 미소핵(MN)과 nucleoplasmic bridge(NPB)의 생성 기전

핵분열 후에 세포질의 어느 한 쪽으로 이동하지 못하고 남은 전체 염색체 혹은 중심절이 없는 염색체 파편으로부터 유래된 MN. NPB는 이중나선 DNA 절단의 misrepair 혹은 telomere 말단끼리의 융합으로부터 생긴 이중심절 염색체(dicentric chromosome)로부터 발생한다. 이런 현상은 핵분열을 마친 세포에서만 관찰되며, cytochalasin B를 첨가하여 세포질 분열을 방해한 경우 관찰될 수 있다.

cytochalasin B를 세포배양액에 첨가하면 림프구 세포분열을 조절할 수 있어 세포분열 유도제에 의한 불균등한 반응을 방지할 수 있다. 이것은 이핵세포(binucleated cell, M1) 만을 계산에 포함시키고, 계속되는 세포분열 단계의 세포(M2, M3, M4 등)를 제외하는 데 중요하다.

  • ㆍ이핵세포 선택과 MN 계산 기준 (Fenech, 2000) : 그림 7-19.
    • 이핵세포는 두 개의 주요 핵이 크기가 비슷하고, 온전한 핵막을 가져야 하며, 세포질 내에서 염색 패턴과 정도가 서로 비슷해야 한다.
    • 핵 지름의 1/4 보다 넓은 nucleoplasmic bridge는 MN으로 계산하지 않는다.
    • 두 핵이 겹쳐있는 경우에는 인접한 각 핵막의 경계가 명확히 구분되는 경우에만 계산한다.
    • 이핵세포의 세포막은 온전해야 하면 인접한 세포의 세포질막과 분명하게 구분되어야 한다.
    • 림프구의 MN은 일반적으로 주요 핵의 지름의 1/16-1/3 정도이다.
    • MN은 주요 핵에 연결되면 안된다.
    • MN은 대개 주요 핵과 염색 정도가 비슷하나, 간혹 MN이 더 진할 수도 있다.

그림 7-19. MN으로 혼동되기 쉬운 경우

  • (a) 세 개의 핵을 가진 삼핵세포. 하나의 핵이 다른 두 개에 비해 작으나 주요 핵 지름의 1/3보다 넓으므로 MN으로
    간주될 수 없다.
  • (b) 세포질 내의 dense stippling
  • (c) 주요 핵과 좁은 bridge로 연결되어 있는 NBUD
  • (d) 핵의 구성 성분으로 이루어진 물질이 주요 핵으로부터 돌출되어 나와 있으나 constriction 혹은 bridge가 없는 nuclear bleb

그림 7-20. 이핵세포에서의 MN의 다양한 형태와 크기

  • (a) 두 개의 MN을 가진 이핵세포로서, 하나의 MN은 주요 핵 지름의 1/3, 다른 하나는 1/9임
  • (b) 주요 핵에 부착되어 있으나, 겹치지 않는 MN을 가진 이핵세포
  • (c) 주요 핵 사이에 NPB를 가지고 두 개의 MN을 가진 이핵세포
  • (d) 다양한 크기의 6개의 MN을 가진 이핵세포 : 이런 이핵세포는 고농도의 유전독성 물질에 노출된 경우 이외에는 매우 드물다.
  • ㆍMN 분석의 장단점 :
    • dicentrics 계수와 염색체 전좌 분석에 비해 술기가 용이하고 신속하여 방사선 노출 사고 후 희생자 선별에 유리하다.
    • dicentrics나 염색체 전좌에 비해 MN은 방사선에 특이적이지 않고, 성별이나 나이에 따라 영향을 받는다. 즉, 방사선 노출과 관계없는 사람에서도 높게 나타날 수 있고, 정상인의 림프구에서 보고된 기저(background) 빈도가 1000개 세포 당 평균 7.8 MN 정도이다(Thierens 등, 2000). 기저 빈도의 증가는 나이에 따라 유의하게 증가하는데, 이것은 whole chromosome loss 때문이라고 알려져 있다. 성별에 따른 차이를 보면, 여성에서 MN의 빈도가 높은데, 이것은 성염색체의 과도한 micronucleation 때문이다. 그 외에도 흡연력이나 기타 유전자 독성물질에 의해서도 MN이 증가될 수 있다(Norppa and Falck, 2003 : Joksic 등, 2004).
    • dicentrics 빈도에 비해 MN의 빈도가 낮아(특히, 고선량에서), 통계적으로 유의한 선량-반응 관계를 얻기 위해서는 더 많은 세포를 분석해야 한다.
  • ㆍradiation-induced MN과 spontaneous MN의 구분 : 그림 7-21.

pancentromeric 및 pantelomeric probe를 사용한 FISH법으로 구분할 수 있다. 즉, spontaneous MN은 단일 염색질을 가진 전체 염색체를 포함하고 있어 centromeric probe에 염색이 된다(C+). 반면, radiation-induced MN 은 염색질형의 말달 파편을 가지는 acentric fragment이기 때문에 centromeric probe에 염색이 되지 않는다(C-).

그림 7-21. pancentromeric probe (흰색)와 pantelomeric probe (검정색)로 보합된 림프구 (화살표는 MN을 표시한다.)

  • (a) 한개의 centromere signal과 두 개의 telomere signals을 가진 spontaneous MN
  • (b) 한 개의 telomere signal을 가진 radiation-induced MN.

현재까지 MN분석은 고선량(≥1 Gy) 노출 시에 최소 200개의 이핵세포를 관찰함으로써 triage를 위한 생물학적 선량평가법으로 유용함이 증명되어 있다. 그러나, 신체 일부에만 제한된 국소 노출이나 저선량의 전신 노출에 대해서는 민감도가 낮아 선별검사로 적합하지 않다고 알려져 있다. 이런 측면에서는, nucleoplasmic bridges (NPB)를 관찰하는 분석법을 고려해 볼 필요가 있다. NPB는 하나 이상의 dicentric 염색체의 중심절(centromere)이 이핵세포의 반대편 극으로 이동하면서 생기는 non-disjunction에 의해 발생한다.

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4) Premature chromosome condensation (PCC) 분석

현재 사용하고 있는 세포유전학적 dosimetry법의 표지자들(dicentrics, 염색체전좌, MN)은 체외에서 세포분열 촉진제에 의해 중기세포를 얻은 후에 분석하는 것이 일반적이다. 전통적으로 림프구 배양(48-72시간) 후에 염색체의 변형과 이에 따른 부산물들을 흡수선량 계산에 이용하는 방식이었다. 이런 방법들은 4 Gy 정도까지의 고선량을 검출하기에는 적합하였다. 그러나 더 높은 선량의 경우에는, 방사선에 의한 세포분열 지연(mitotic delay), 세포 사멸 등이 심해서 실제 보다 낮게 흡수선량이 계산될 수 있다. 이와는 달리, PCC 분석은 급성 고선량 노출을 평가하는데 유용하다. PCC법에 의하면 채혈 후 3-4시간 이내에 간기(interphase)세포에서 방사선에 의한 손상 정도를 검사할 수 있는데, 분열지수(mitotic index)가 매우 낮은 경우라도 분석이 가능하다. PCC는 림프구를 유사분열 세포인 Chinese hamster ovary(CHO)와 융합시키는데, 이때 융합제로 polyethylene glycol, okadaic acid, calyculin A, virus 등을 이용한다. 림프구와 CHO 세포의 융합과 염색체 응축은 사용한 융합제에 따라 달라진다. 예를들어, polyethylene glycol을 사용하면 CHO 세포가 유사분열 인자(mitotic factor)를 분비하여 간기 림프구에 작용하여 조기 응축을 촉진한다 (Gotoh 등, 2006).

PCC분석에서 관찰되는 염색체의 형태는 분석되는 림프구가 융합 시 세포 분열의 어느 단계에 있었는지에 의해 다음과 같이 달라진다(Ravi 등, 2007). :

    • G1-phase 세포는 단일 염색질(single chromatid)을 가진다.
    • S-phase 세포는 조각나고 쪼개진 염색체를 포함하고 있다.
    • G2-phase 세포는 길게 연장된 이중 염색질(double chromatids)을 가진다.

최근에 세포유전학적 선량평가의 표준법인 dicentric 염색체 계수법과 PCC 분석을 비교한 연구에 의하면(Lindholm 등, 2010), PCC법에 의한 ring chromosome이 dicentric 염색체 보다 6 Gy를 초과하는 고선량 노출 시에 더 유용한 표지자(radiation-induced biomarker)라고 한다. 반면, dicentric 염색체는 1-6 Gy 정도의 전신 저선량 노출 (whole-body low-dose) 시에 유용한 것으로 제안하였다. 따라서 PCC 분석은 다수의 사람들이 고선량(5-50 Gy) 방사선에 노출된 것이 의심되는 응급상황에서 즉각적인 의학적 처치가 필요한 환자를 선별하기 위해 필요할 것으로 보여진다(Emamchai 등, 2009 : Wanga 등, 2009).

5) Molecular biomarkers

생물학적 선량평가의 새로운 방법인 분자생물학 표지자 분석

새로운 기술이 출현하면서 물리-화학적 자극에 대한 세포의 반응 기전을 이해하는 분야에도 분자유전학적 기법들이 도입되었다. 이런 기법들을 이용해서 방사선에 의한 DNA 손상을 반영하는 여러 가지 유전자의 감소, 발현 억제, 과발현 등이 연구되고 있다. 최근 들어 방사선 노출에 의해 유의하게 변화되는 인자로서 거론되고 있는 몇 가지 인자들, glycophorin A(GPA), hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase(HPRT), p53 단백 등에 대해 소개한다.

(1) Glycophorin A (GPA)

4번 염색체 장완(4q28-31)에 위치한 GPA 유전자는 인간 적혈구의 표면 시알로글리코단백(sialoglycoprotein)을 발현한다. GPA 단백은 세포 당 5×105 copies 정도 존재하는데, 131개의 아미노산 중 2개가 다른 GPA M형과 N형이 있다. GPA M과 N은 각각 형광염료가 결합된 단클론항체와 반응하여 유세포분석기(flow cyotmetry)로 분석된다. 가장 흔한 GPA 유전자형은 MN 형이다. 이 밖에도 NO, MO, NN 및 MM형 등이 있는데, hemizygous인 NO와 MO형은 유전자의 점돌연변이(point mutation) 혹은 결손(deletion)에 의해 발생하고, homozygous인 MM과 NN형은 세포분열 시 missegregation, somatic recombination 등의 기전에 의해 발생한다.

GPA 변이형 중에서 특히 NO와 NN은 과거에 1 Gy 이상의 고선량에 노출된 경우에 지속적으로 나타나는 표지자로 보고되고 있다. 골수에서 이들 변이형이 일단 생성되어 말초혈액 중에 순환되면 dicentrics와 달리 지속적으로 나타난다고 한다(Ha 등, 2002). GPA 분석은 다음과 같은 장점을 가진다. :

    • 분석 비용이 저렴하다.
    • 분석에 필요한 혈액량이 적다(1 mL).
    • 채혈된 혈액은 분석 시까지 4°C에서 1주일 가량 저장할 수 있다.
    • 유세포분석기(flow cytometry)를 이용하면 분석 시간을 단축할 수 있어 대량의 역학조사에도 적합하다.
    • 환경 요인이나 개인의 생활 양식에 영향을 받지 않는다.

반면, 이 표지자는 선량과 직선관계(linear dose dependence)를 보이며, 말초혈액 내의 적혈구에는 핵이 존재하지 않기 때문에 자세한 돌연변이 스펙트럼을 얻기 힘들다는 제한점이 있다(Jones 등, 2001). 기타 다음과 같은 제한점 역시 고려되어야 한다. :

    • GPA 분석을 체외에서 보정할 수 있는 시스템이 없다.
    • 전 인구의 50% 미만인 MN heterozygote 만이 분석에 이용될 수 있다.
    • 1 Gy 미만의 저선량 노출에는 이용할 수 없다.
    • 개인별 차이(inter-individual variation)가 크다.

장점과 단점을 모두 고려하면, GPA 분석은 다른 세포유전학적 선량분석법과 함께 보완적으로 이루어져야 한다. 그러나, 고선량 방사선의 노출 시 대량 인구집단에서의 평균 흡수선량을 구하는 목적으로는 유용할 것이다(Kleinerman 등, 2006). International Commission on Radiation Units and Measurements(ICRU)에서도 GPA 분석과 다른 생물학적 분석을 병행하기를 권장하고 있다.

(2) Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HPRT)

HPRT를 코딩하는 유전자는 X 염색체의 장완(Xq26)에 위치하고 있다. HPRT는 퓨린 대사에 관여하는 효소로서 세포의 생존에는 필수적이지 않다. 말초혈액 T-림프구의 HPRT 유전자에 돌연변이가 발생하면 HPRT를 발현하지 못한다. 이런 돌연변이 클론을 계수하고 선별적 방법(6-thioguanine 유무를 조절)으로 성장시켜 방사선에 의한 변이 연구에 이용하고 있다(Bigbee 등, 1998).

현재까지 알려진 바에 의하면, HPRT 유전자는 double-strand breaks (DSB)의 재결합에 의한 대규모 유전자 재배열이 일어나는 곳이다. DSB 때문에 dicentric 염색체를 가진 세포가 생존하기 어려움을 고려하면, HPRT 유전자는 방사선 노출 직후의 유일한 표지자가 될 수 있다. 이 방법은 나이, 흡연 등과 같은 생활 유형에 의한 혼동요소(confounding factor)를 교정한다면 분석 민감도를 향상시킬 수 있을 것이다.

(3) P53 단백 발현

p53 유전자는 17번 염색체에 위치한 종양억제 유전자이다. 이 유전자로부터 발현하는 p53 단백은 DNA에 결합하여 세포 생존에 관여하는 여러 가지 유전자의 전사(tranion)를 조절한다. DNA가 손상되면 p53 유전자가 활성화되어 세포 주기를 멈추게 하고 DNA repair를 유도하기 때문에 유전자 완전성을 유지하는 데에 필수적이다. 반면, p53 유전자에 돌연변이가 생기면 DNA와 효과적으로 결합하지 못하고 관련 유전자의 발현을 적절하게 조절하지 못한다. 따라서 적절한 세포사멸(apoptosis)를 유도하지 못하여 계속적인 세포 분열을 통해 종양을 형성하게 된다(Bahl 등, 2000).

정상적으로 p53은 세포질에 낮은 농도로 존재하며 반감기도 짧다(6-20분). 그러나, 유전자 독성물질에 의한 스트레스 신호가 주어지면 반감기가 수 분에서 수 시간까지 길어져 p53 단백의 농도가 증가한다. 따라서 스트레스 상황에서는 p53 단백의 농도를 측정할 수 있으며 주어진 스트레스의 정도와 농도의 관계를 규명할 수 있게 된다(Novellino 등, 2003; Rossner 등, 2004; Riley 등, 2008). 실제로 몇 몇 연구에서 p53 단백의 농도를 개인의 이온화방사선 흡수선량의 표지자로 사용하려는 시도가 있었다(Lu-Hesselmann 등, 2006; Cavalcanti 등, 2008). 건강인으로부터 얻은 혈액을 방사선 조사한 경우와(a) 조사하지 않은 경우(b)의 p53 단백 발현 정도를 유세포 분석기로 분석한 데이터가 그림 7-22에 제시되어 있다. 방사선 조사에 의해 p53 단백 발현이 증가해 있음을 증명하였다. 이런 방법들은 선량 평가에 소모되는 시간을 단축하고 대량 선별을 가능하게 하지만, 실제로 수행하기 위해서는 추가적인 검증과 유용성 평가가 필요하다.

그림 7-22. 방사선 4 Gy를 조사한 혈액(a)과 방사선을 조사하지 않은 혈액(b)의 유세포 분석 림프구는 phycoerythrin (PE)으로 conjugate된 p53 단클론항체와 결합된 상태이며, 결과는 dot-plot 포맷으로 보여지고 있다. p53 항체에 양성으로 나타나는 세포들은 up left 사면에 보여지고 있으며, FL1 채널을 형광 없이 세포 크기를 나타낸다.

그림 7-22. 방사선 4 Gy를 조사한 혈액(a)과 방사선을 조사하지 않은 혈액(b)의 유세포 분석

결론

세포유전학적 선량평가는 물리학적 선량평가와 함께 개인의 방사선 노출 관련 위험도 평가에 필수적인 수단이다. dicentric 염색체 계수법이 표준이며, FISH 기법을 이용한 염색체 전좌 분석이 널리 쓰이고 있다. 그러나, 분자유전학적 기법들이 실용화 되면서, 선량평가 분야에서도 유세포 분석이나 PCR 등을 이용한 방법들이 새로운 선량평가 기법으로 제안되고 있다. 분자유전학적 선량평가는 분석에 필요한 검체량이 적고, 분석 시간이 빠르다는 장점이 있지만, 방사선에 의한 DNA 손상을 정확하게 반영할 수 있는 표지자가 우선 개발되어야 하고, 표지자와 흡수선량과의 관계에 대한 검증이 이루어져야 한다. 또한, 방사선의 특성(low and high-LET), 선량률(dose rate), 조사 조건(whole- and partial-body) 및 환경과 개인의 생활 습성 등의 다양한 인자들이 체내에서 방사선에 대한 반응도에 미치는 영향에 대해서도 지속적인 연구가 필요하다.

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최종수정일 :2019/11/27
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